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酶聯(lián)免疫斑點實驗(ELISPOT)
ELISPOT法源自ELISA，又突破傳統(tǒng)ELISA法，是定量ELISA技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。
從單細胞水平觀察分泌蛋白的表達已成為目前研究細胞功能的重要內(nèi)容，酶聯(lián)免疫斑點法(ELISpot)技術(shù)巧妙地運用了酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，從方法上解決了該難題，已廣泛運用于各項重要課題研究中。ELISpot最初用于檢測分泌抗原特異性抗體的個體B細胞，以后該方法不斷改進，用于檢測分泌特定抗原的單個細胞。
實驗方法原理：
ELISPOT技術(shù)原理，一句話概括就是：用抗體捕獲培養(yǎng)中的細胞分泌的細胞因子，并以酶聯(lián)斑點顯色的方式將其表現(xiàn)出來。
實驗材料：
1.細胞
2.70％乙醇 、PBS、 脫脂奶粉 、鏈霉親和素 、檢測抗體、 包被抗體
3.PVDF膜、 96孔培養(yǎng)板 、硝基纖維素底板、 免疫斑點板、 酶標板
實驗步驟：
一、包被96孔板
1.用70％乙醇浸潤96孔板中的PVDF膜30 s
2.加入捕獲抗體（PBS稀釋），4℃過夜
3.倒空板中包被液，輕輕在紙上拍干，用PBS洗滌，禁用洗板機
4.加入100ul 2%的脫脂奶粉（或者BSA）室溫孵育2小時，封閉板中空白位點
5.PBS洗滌1次。（如果暫時不用，可將96孔板干燥后4保存，可保存2周以上）
二、細胞刺激和細胞因子捕獲
從新鮮血液中用Ficoll分離PBMC并進行計后，將細胞用培養(yǎng)液稀釋后加入96孔板中。細胞數(shù)量需要優(yōu)化，最好進行備比稀釋以確定合適的細胞數(shù)量。通常所用細胞數(shù)量為1-2×105/孔。
將96孔板在37℃ CO2孵箱中孵育過夜。禁止移動或晃動板子。
用含0.1% Tween 20 的PBS孵育10分鐘，去除細胞和未結(jié)合的細胞因子。然后用含0.1% Tween 20 的PBS洗滌3次。 禁用洗板機。
三、加入檢測抗體檢測
加入標記的檢測抗體（用含1％BSA的PBS稀釋），室溫孵育1-2小時。
加入底物顯色（如果檢測抗體為酶標）或者熒光直接檢測（如果檢測抗體是熒光標記）：在加入底物之前用蒸餾水洗滌板子膜的兩側(cè)，以防止部分溶液漏出后導(dǎo)致的背景。監(jiān)測斑點的形成，適時終止反應(yīng)。
用蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。
